משנים את כללי המשחק...

מאת: מושית מגן, בן משה

באת אלי את עיני לפקוח,
וגופך לי מבט וחלון וראי,
באת כלילה הבא אל האוח
להראות לו בחושך את כל הדברים.
לאה גולדברג (סליחות)

ההדמיה המקרוסקופית פרצה בסערה אל תוך המילניום השלישי בעיקר הודות לשימוש ב-EMCCD שהפך לסופרסטר החדש של טכנולגית הגלאים להדמיה ברמות אור אולטרה נמוכות, על גבול רמות האור הרציף.
השמוש ב-EMCCD בצד שיפורים באמצעים אופטים ויכולות מחשוב חדשות, הביאו למהפכה ביכולת ההדמיה של תאים חיים, במהירויות, כאשר הפרדה ורגישויות שרק לפני עשור היו בגדר הדמיון בלבד.
פריצת הדרך בפתוח (EM-ccd) אשר בו אלקטרונים מוכפלים על פני השבב, אפשרה הדמיה ברמה של מולקולה בודדת. מצלמות דור חדש של CMOS מדעי (SCMOS) שנכנסו לשוק בשנים האחרונות, מאפשרות הדמיה במהירות גבוהה ורמות רעש נמוכות, תוך שמירה על רמת הפרדה מרחבית, ברמות שמצלמות EMCCD מתקשות להגיע בגלל רעש רקע עודף.
המצלמה החדשה ORCA-Flash 4.0 של חברת ה-HAMAMATSU PHOTONICS משתמשת בטכנולוגיה החדשה של sCMOS.
אשר בנוסף ליעילות קוונטית גבוהה (QE) היא נהנית מרעש נמוך, במהירות ורזולוציה גבוהות.
הופעתה של מצלמת sCMOS החדשה, הסירה את הבלעדיות שהיתה למצלמת EM-ccd בשוק המקרוסקופיה המדעית ודורשת מהמדען שיקולים חדשים לגבי המערכת הנדרשת כדי לקבל הדמיה טובה ביותר.

על המדען להכיר בכך כי בחירת המצלמה עבורו היא רק חלק אחד מתוך משוואת ההדמיה, עליו להתחשב ברמות הרקע בדוגמא אותה הוא בודק וגם במערכת האופטית בה הוא משתמש. בחירת המצלמה הטובה ביותר לצרכיו של המדען היא קריטית עבורו, כי במחקר מושקע כסף רב ונדרש ציוד יקר כדי להפיק תוצאות הדמיה כמותיות.
להלן שקולים בבחירת מצלמה בתלות בסוג החומר הנחקר ואיכות המערכת האופטית:
מצלמות CCD מסורתיות ימשיכו להיות שימושיות בתנאים של זרם חושך נמוך היכולות לשמש עבור אפליקציות הדורשות זמן חשיפה ארוך.
Em-CCDs היא עדיין המצלמה הטובה ביותר עבור אפליקציוות שיש בהם אור נמוך ביותר (<4 פוטונים/פיקסל) ועבור יישומים שיש להם אותות רקע זניחים.
במצלמה ORCA, Flash 4.0 יש שילוב של QE גבוה read noise, ורעש רקע נמוכים. מצלמה זאת מסוגלת להחליף את ה-CCDs המסורתיים וה-em-CCDs ברוב השימושים של מחקר פלורסנטי. בנוסף לכך יכולת הרגישות שלה שווה או גדולה יותר מ-em-CCDs ברמות אור מעל (4 פוטונים/פיקסל), שהיא מכסה את מרבית המקרים במחקר הפלורוסנטי. ORCA, Flash 4.0 מציעה תחום גדול של field of view וגם frame rate מהיר יותר מאשר EM-ccds.
בכל מקרה על המדען להתחשב באותות הרקע של הדוגמא והמערכת האופטית. אותות הרקע הם פקטור מכריע בבחירת סוג המצלמה.

איך נשווה בין טכנולוגיות EM-CCD, CCD ו-sCMOS?
מה שנראה כמשימה מרתיעה, במציאות מסתכם בכמה משוואות וידע לגבי הדוגמא שאותה רוצים לחקור. המטרה היא לא רק ללכוד תמונה, אלא גם חשוב מאד שניתן יהיה להפיק ממנה אינפורמציה מדעית. ראה התמונה (איור 1). באופן כללי מאוד אנו בודקים כדלהלן:
דוגמא (פוטונים מהחומר הנבדק ומהרקע) ->אופטיקה->מצלמה->תמונה.
המטרה היא לקבל תמונה של החומר הנבדק באופן המייצג בצורה הטובה ביותר את המצב שלו במציאות.
החומר הנבדק, האופטיקה והמצלמה הם שלושת המרכיבים החיוניים כדי לקבל את התמונה. הרעש הנלווה לכל תמונה מקרוסקופית הוא האויב מספר אחד של המדען המבקש לחקור התנהגות של חומר תחת המקרוסקופ.
תפקידם של המהנדסים המיצרים את המצלמה ואת האופטיקה היא לשמור על נאמנות התמונה על ידי צמצום תרומת הרעש של רכיבים אלה על הפלט. עבור המצלמות, משמעות הדבר היא שמירה על רעש נמוך ככל האפשר.
כדי לפשט את המורכבות של אותות המתקבלים מהדוגמא הנבדקת (עם ובלי רעש רקע) ומערכות אופטיות, נבדוק את המצלמה תחילה ונניח כי יש לנו מצלמה עם גלאי מושלם (במקרה זה נתיחס ל-CCD או sCMOS). הגלאי המושלם הוא גלאי ללא רעש, כל פוטון מומר ל-Photoelectron היעילות קוונטית, QE=100%, האות הנמדד קבוע, המתח על כל פיקסל מומר בדיוק לאותו ערך דיגיטלי (Read Noise, Nr=0), אין מקורות רעש כתוצאה מהגברה multiplicative (גורם רעש, Fn=1). כמובן, יש תכונות אחרות כגון (גודל פיקסל, Read out speed וכו‘), שראויים להתיחסות, אבל בגדול אם נוכל למנוע את הרעש לחלוטין, נוכל להגיע לגלאי אידיאלי. מהנדסי מצלמות מנסים ליצור את הגלאי האידיאלי מאז ה-CCD הראשון בשנת 1970. עדין אנחנו לא שם אבל משתדלים.

ביצועי פיקסל של המצלמה המושלמת
לצורך הדיון נבחן את המשמעות של גלאי מושלם במונחים של רגישות פיקסל. רגישות ואיכות התמונה במונחים של יחסי אות לרעש (SNR) כפונקציה של מספר פוטונים הנקלטים (איור 2א). יחס אות לרעש יכול להיות מחושב על פיקסל אחד או ממוצע של פיקסלים באזור מסוים. ברוב המקרים אנו מעונינים בממצוע של איזור פיקסלים, אך לשם הפשטות נבחן יחס אות לרעש בעוצמות אור שונות עבור פיקסל בודד.
הנוסחה לחישוב קואורדינטה של יחס אות לרעש SNR היא:

QE: quantum efficiency
S: input signal (photon/pixel)
Fn: noise factor
Nr: readout noise
M: EM gain (=1 for CCD/CMOS)
Ib: background
Nd: dark noise (not included, assumed to be negligible)

במקרה היפותטי של גלאי מושלם וסיגנל אידיאלי (כלומר, ללא
רקע), המשוואה תראה כדלהלן:

נקודה חשובה שיש לשים אליה לב, גם לגלאי מושלם, האות תמיד יהיה מלווה ברעש. רעש זה הוא פונקציה של סטטיסטיקת הפוטון ונקרא רעש ירייה (shot noise) של הפוטון. כל עוד התכונות הבסיסיות של פיזיקת הקוונטים תקפות, לאמור לא יכולים להיות פוטונים חלקיים, אנחנו נשאר תקועים עם (shot noise) הזה. כיוון שיחס אות לרעש במקרה אידיאלי שוה לשורש של מספר הפוטונים שהפיקסל רואה, אנחנו תמיד נשאף לאסוף כמה שיותר פוטונים כדי לשפר את היחס אות לרעש.
נבחן כעת שני מקרים של רמות האור
שהגלאי האידיאלי שלנו רואה:
1) אות הכניסה גבוה (פוטונים 1000/ פיקסל)
2) אות כניסה נמוך (10 פוטונים/ פיקסל).
3) מקרה 1, מצלמה מושלמת, רמת אות גבוהה:
S=1000, Ib=0, M=1, QE=1, Nr=0